Méthode de Kjeldahl

Pour doser les protéines contenues dans un échantillon par la méthode de Kjeldahl, on procède d'abord à la minéralisation. Pour cela, on introduit dans un matras (fiole) :

• la quantité m de l'échantillon ;
• un volume d'acide sulfurique (en général 50 ml) ;
• le catalyseur du sulfate de potassium et du sulfate de cuivre (soit sous la forme de cristaux, soit sous la forme de pastille) ;
• un anti-moussant (pratique pour la phase de distillation et refroidissement après la minéralisation).

La minéralisation se fait en général dans un minéralisateur pendant 1 h 30 min à 3 h. On fait la minéralisation sous une hotte (les vapeurs de la minéralisation sont très irritantes et toxiques à cause de l'acide sulfurique) ou par une aspiration par cloche qui récupère le dégagement d'acide pour le faire passer dans de l'eau puis dans une solution de soude d'un indicateur coloré (généralement le bleu de bromothymol).

On laisse refroidir et on introduit avec précaution de l'eau distillée. Attention : l'ajout d'eau dans un acide fort, comme ici l'acide sulfurique, peut engendrer une très forte réaction, voire une explosion.

La fiole contient désormais les atomes d'azote sous la forme de sel d'ammonium (sauf les nitrates et les nitrites).

Schéma du montage, voir l'article Distillation.

On place la fiole dans un distillateur. Elle est reliée à une solution d'acide borique saturée, de rouge de méthyle et de bleu de bromothymol (en milieu professionnel on utilise un appareil de distillation à entraînement à la vapeur, le dosage se réalise généralement par pH-métrie).

Rajouter de la soude concentrée en excès tout en chauffant légèrement la fiole afin de faire virer le pH en milieu basique, ce changement de pH va transformer les sels d'ammonium en ammoniac qui va « s'évaporer ».

L'ammoniac va passer par un réfrigérant qui va entraîner son retour sous sa forme liquide puis va couler dans l'acide borique (dosage direct) ou dans de l'acide fort en excès (dosage indirect) qui va l'emprisonner (voir principe).

On effectue un dosage acido-basique direct ; il existe une méthode indirecte : on remplace l'acide borique par de l'acide sulfurique en excès et on dose après la distillation cet excès d'acide.

L'acide borique n'a aucun effet sur le pH (acide faible).

Doser l'ammoniac par une solution titrée d'acide sulfurique ou d'acide chlorhydrique. L'équivalence est marquée par une coloration rose due au rouge de méthyle.

Par précaution, retirer la solution avant de stopper le chauffage pour éviter tout siphonnage.

Exemple pour l'acide chlorhydrique (attention : l'acide sulfurique est un diacide).

Recherche du résultat en g% (m/V) :

1 mol d'acide réagit avec 1 mol d'ammoniaque donc on obtient l'égalité suivante :

1 mol d'acide = 1 mol d'ammoniaque (noté mol N)

Sachant que :

n (mol) = C (mol/L) * V (L)

on arrive à :

mol N = C de l'acide (noté C1) * V de l'équivalence (noté Va).

soit :

mol N = C1 * Va

Sachant que :

m N(masse de l'azote) = M masse molaire de l'azote (g/mol) * n N (mol)

soit :

m N = M * C1 * Va

on cherche un résultat en g%, on multiplie par 100 et on divise par la masse de l'échantillon.

Pour doser les protéines contenues dans du lait par cette méthode, on procède d'abord à la minéralisation. Pour cela introduire dans une fiole :

• 2 ml de lait exactement mesuré ;
• 15 à 20 ml d'acide sulfurique concentré ;
• 6 g de sulfate de potassium ;
• 1 g de sulfate de cuivre ;
• quelques grains de pierre ponce.

On porte à ébullition. Puis, à partir de l'éclaircissement de la solution, on prolonge l'ébullition pendant trois heures.

On laisse refroidir et on introduit avec précaution de 30 à 50 ml d'eau distillée.

On réalise un montage de distillation :

dans le ballon, on introduit :

• le contenu de la fiole (voir ci-dessus) soigneusement rincé (pour en extraire tous les composés azotés ; on complète à 250 ml avec de l'eau distillée ;
• quelques gouttes de phénolphtaléine ;
• de l'hydroxyde de sodium à 400 g/l jusqu'à ce que le contenu du ballon devienne rose.

On plonge le bout du réfrigérant dans un bécher contenant 20 ml d'acide borique et 2-3 gouttes de rouge de méthyle.

On chauffe modérément le ballon.

On dose l'ammoniac, au fur et à mesure de son dégagement, par une solution titrée d'acide sulfurique à 0,05 mol/l. Le dosage est terminé dès que la coloration reste stable pendant environ 5 min.

x représente l'avancement de la réaction. Dans la première réaction, l'ammoniac est mis en présence d'un excès d'acide où une partie n' de l'acide réagit. On fait réagir le restant de l'acide n'' avec la soude. ${\displaystyle {\rm {nH_{3}O^{+}=n'+n''}}}$, c'est un dosage en retour.

	${\displaystyle {\rm {NH_{3}}}}$	${\displaystyle {\rm {H_{3}O^{+}}}}$	${\displaystyle \longrightarrow }$	${\displaystyle {\rm {NH_{4}^{+}}}}$	${\displaystyle {\rm {H_{2}O}}}$
État initial	${\displaystyle {\rm {nNH_{3}}}}$	${\displaystyle {\rm {n'H_{3}O^{+}}}}$		${\displaystyle 0}$	excès
État intermédiaire	${\displaystyle {\rm {nNH_{3}-x}}}$	${\displaystyle {\rm {n'H_{3}O^{+}-x}}}$		${\displaystyle x}$	excès
État final	${\displaystyle 0}$	${\displaystyle 0}$		${\displaystyle x_{max}}$	excès

• ${\displaystyle {\rm {nNH_{3}-x=0}}}$
• ${\displaystyle {\rm {n'H_{3}O^{+}-x=0}}}$
• donc ${\displaystyle {\rm {nNH_{3}=n'H_{3}O^{+}}}}$

	${\displaystyle {\rm {H_{3}O^{+}}}}$	${\displaystyle {\rm {OH^{-}}}}$	${\displaystyle \longrightarrow }$	${\displaystyle {\rm {2H_{2}O}}}$
État initial	${\displaystyle {\rm {n''H_{3}O^{+}}}}$	${\displaystyle {\rm {nOH^{-}}}}$		${\displaystyle 0}$
État intermédiaire	${\displaystyle {\rm {n''H_{3}O^{+}-x}}}$	${\displaystyle {\rm {nOH^{-}-x}}}$		${\displaystyle {\rm {2x}}}$
État final	${\displaystyle {\rm {0}}}$	${\displaystyle {\rm {0}}}$		${\displaystyle {\rm {2x_{max}}}}$

${\displaystyle {\rm {n''H_{3}O^{+}-x=0}}}$

${\displaystyle {\rm {nOH^{-}-x=0}}}$

donc ${\displaystyle {\rm {n''H_{3}O^{+}=nOH^{-}}}}$

${\displaystyle {\rm {nH_{3}O^{+}=n'H_{3}O^{+}+n''H_{3}O^{+}}}}$

${\displaystyle {\rm {H_{3}O^{+}=nNH_{3}+nOH^{-}}}}$

${\displaystyle {\rm {2C_{H_{2}SO_{4}}\times V_{H_{2}SO_{4}}=C_{NH_{3}}\times V_{NH_{3}}+C_{NaOH}\times V_{NaOH}}}}$

${\displaystyle {\rm {C_{NH_{3}}={\frac {2C_{H_{2}SO_{4}}\times V_{H_{2}SO_{4}}-C_{NaOH}\times V_{NaOH}}{V_{NH_{3}}}}}}}$

Une mole de NH₃ provient d'une mole d'atomes d'azote (N). Donc en retrouvant le nombre de moles d'atomes d'azote, on peut en déterminer la concentration massique.