Microbiologie

Les procaryotes Prokaryota ou Prokarya), du grec pro (avant) et caryon (noyau), sont des organismes dont la cellule ne possède pas de noyau cellulaire ni d'autres organites, ils appartiennent à au moins deux taxons distincts :

• les archéobactéries ou archées sont un groupe particulier, car il ne comprend essentiellement que des espèces anaérobies (n'ayant pas besoin d'oxygène, voire souvent ne tolérant pas l'oxygène), vivant dans des environnements extrêmes : on parle d'organisme extrémophile. Les environnements extrêmes sont à la limite des conditions tolérées par les cellules biologiques (milieu salin très acide ou très alcalin, milieu à température proche de l'ébullition). Les archéobactéries ne sont pas que des extrémophiles, ce sont aussi des organismes plus communs qui vivent dans des conditions de vie classique comme les marais ou les rumens des ruminants. Il ne faut pas associer systématiquement archéobactéries à des organismes extrêmes même si on retrouve parmi eux la plupart des extrémophiles ;
• on retrouve les eubactéries dans notre quotidien, sol, nourriture, etc. Ce sont les bactéries les plus connues. Cependant certaines eubactéries sont aussi extrémophiles.

Ces micro-organismes ont des mécanismes pour résister à ces conditions.

Les eucaryotes ont un système membranaire interne enfermant des organites (noyau, plaste, mitochondrie, etc.) ; ils présentent un cytosquelette interne (actine, tubuline) absent chez les procaryotes, qui leur confère une taille souvent plus importante que les procaryotes.

On estime que chaque groupe d'eucaryotes a eu un ancêtre parmi les procaryotes (archéobactéries ou eubactéries), et que les mitochondries (et peut-être aussi d'autres organites comme les chloroplastes) présents dans le cytoplasme des eucaryotes actuels ont aussi eu au moins un ancêtre procaryote distinct qui aurait colonisé cette ancienne bactérie pour vivre en symbiose (endosymbiose) avec elle et former tous les eucaryotes qui ne peuvent plus vivre sans elles.

En effet, on retrouve dans les mitochondries un cytosquelette interne spécifique, une structure membranaire externe complexe, un matériel génétique interne spécifique logé dans une zone plasmique appelée proto-noyau (dépourvu de membrane mais tout de même structurée), même si les mitochondries ne peuvent se multiplier seules sans le concours de la cellule hôte (les mitochondries auraient perdu leurs facultés de reproduction qui ne leur étaient plus nécessaires, puisque la cellule hôte leur fournit pratiquement tout le matériel nécessaire à leur croissance et leur division).

Contrairement aux champignons et aux protozoaires, les algues ont des pigments chlorophylliens leur permettant de réaliser la photosynthèse.

Elles sont donc des organismes vivant immobile et autotrophes.

Les algues sont présentes dans le sol, les plantes, l'eau douce et l'eau de mer.

Le mot « algue » n'a pas de sens d'un point de vue phylogénétique, c'est-à-dire que l'ancêtre commun à toutes les algues est celui des eucaryotes.

Les champignons sont présents dans le sol, plantes, débris végétaux, lichen, parasites de l'homme, des animaux et des plantes.

Remarque : une levure, eucaryote unicellulaire, est un champignon. Il existe de nombreuses espèces de levures comme Saccharomyces cerevisiae (levure de boulangerie), la famille des Candida (responsables des candidoses), Rhodotorula (parfois retrouvée dans la choucroute qu'elle colore en rouge), Schizosaccharomyces, etc.

Les champignons sont « absorbotrophes » : ils se nourrissent par absorption. Ils sécrètent des enzymes qui digèrent des polymères dans le milieu extérieur, ce mécanisme chimique transforme par exemple les glucides en monomères (petites molécules) qui sont ainsi absorbés.

Les champignons constituent un groupe biphylétique, car une partie d'entre eux, les eumycètes, appartiennent aux opistocontes, et une autre, les oomycètes, aux hétérocontes.

Les micro-organismes ont besoin :

• d'une source d'énergie ;
  • pour les chimiotrophes, elle provient de la dégradation de composés chimiques (par exemple du glucose),
  • pour les phototrophes, de la lumière ;
• d'une source de carbone ;
  • pour les autotrophes, il suffit de CO₂ atmosphérique (carbone minéral),
  • pour les hétérotrophes, elle provient de molécules organiques (CH₄, oses, etc.) ;
• de macroéléments (ainsi appelés en raison de leur concentration dans le milieu de culture) : C, H, O, N, S, Na, Mg, P, K. Les éléments carbone, azote, phosphore doivent être présents aux proportions 100/10/1 pour un milieu correct ;
• de microéléments : Cu, Co, Zn, Cl, Fe, etc. ;
• d'une source d'azote, d'origine minérale (sel d'ammonium) ;
• de facteurs de croissance pour les auxotrophes : vitamines, acides aminés, bases azotées. Les bactéries prototrophes sont celles qui n'ont pas besoin de facteur de croissance ;
• de dioxygène (oxygène moléculaire) pour les aérobies strictes, ou d'absence de dioxygène pour les anaérobies stricts ; pour ces derniers micro-organismes, le peroxyde d'hydrogène (H₂O₂) formé par la réaction entre l'O₂ et l'H₂O les empoisonnent, car ils ne possèdent pas une catalase dégradant H₂O₂, à l'inverse des individus aérobies. Il existe également des micro-organismes aérobies facultatifs capables de se multiplier en présence ou en l'absence d'oxygène grâce à leur capacité à utiliser la fermentation et des bactéries microaérophiles qui ne se développent qu'à une certaine pression en dioxygène ;
• de facteurs physico-chimiques :
  • pour le facteur température, on distingue trois catégories de micro-organismes selon leur optimum de croissance. Les psychrophiles ont leur optimum à 15 °C, les mésophiles à 37 °C, les thermophiles à 65 °C. Il faut descendre au-delà de −18 °C pour arrêter toute croissance microbienne. À 3 °C, il y a peu de risques lié aux bactéries pathogènes (mésophiles, donc virulentes à la température du corps) ou toxinogènes, seules quelques bactéries vivant à ces températures peuvent être dangereuses (listéria),
  • pour le facteur pH, on considère que les bactéries préfèrent la neutralité excepté pour les bactéries lactiques. Pour les levures et moisissures, le pH optimum est plus acide (pH=5).

On distingue deux sortes de milieux de culture :

• synthétiques : milieux dont on peut donner la composition chimique complète. Les milieux synthétiques sont utilisés en recherche fondamentale ;
• empiriques : milieux dont on ne connaît que partiellement la composition.

et parmi ces deux types de milieux, il existe des milieux sélectifs (qui vont permettre de sélectionner le type de micro-organismes qui pourront s'y multiplier). On peut ainsi choisir de ne laisser se développer qu'un genre de bactérie donné (ex: milieu mFC pour les coliformes fécaux ou gélose au sang pour certains pathogènes) ou au contraire de favoriser le développement des levures-moisissures en ajoutant un antibiotique au milieu. La température à laquelle on incubera les milieux inoculés constitue également un facteur de sélection comme mentionné plus haut.

Les milieux de culture peuvent contenir des extraits de levure (cellules de levure déshydratées et lysées) qui fournissent une source d'acides aminés, de vitamines et d'azote, des extraits de malt apportant une source de carbone, des peptones (protéines animales, de poisson, de caséine de lait) source d'azote organique qui intéresse les individus hétérotrophes.

Ces milieux sont soit liquides, soit solides. Pour solidifier le milieu on utilise fréquemment la gélose ou agar-agar, un polymère de sucre tiré d'une algue rouge présentant la propriété de former avec l'eau un gel solide si la température est inférieure à 60 °C.

Un challenge test est une technique permettant de démontrer l'efficacité anti-microbienne (bactériostatique ou bactéricide) d'une substance donnée (produits pharmaceutiques, cosmétiques ou agroalimentaires par exemple).

Cette technique consiste à inoculer une quantité connue de différents germes microbiens (bactéries, levures, moisissures, etc.) dans la substance à tester, puis de dénombrer ces germes à diverses échéances.

Ce test permet notamment de valider la date limite de consommation (DLC) ou la date limite d'utilisation optimale (DLUO) d'un produit.

La stérilisation est l'opération qui consiste à éliminer les micro-organismes d'un objet et ce, de manière durable. En microbiologie, le but de la stérilisation est d'une part maîtriser les micro-organismes introduits dans le milieu d'étude, et d'autre part éviter la contamination du milieu extérieur et des personnes (voir aussi l'article sur l'hygiène).

Il existe trois façons pour stériliser un milieu de culture. Une destruction par la chaleur, par une méthode de filtration ou par l'emploi de radiation et d'agent chimique (gaz).

On distingue les procédés à chaleur « sèche » ou « humide ».

Figure 1 : zone de stérilité d'un bec Bunsen.

• chaleur sèche :
  • bec Bunsen : tout l'air qui se trouve dans un globe virtuel de quinze centimètres de rayon de la flamme d'un bec Bunsen, est passé une fois dans la flamme. Ceci crée une enceinte fictive stérile. Les microbiologistes travaillent avec une flamme oxydante qui crépite,
  • « four Pasteur » ou « four Poupinel » : c'est un four classique utilisé à 180 °C pendant 90 minutes au minimum. Il est moins efficace que l'autoclave (et consomme plus d'énergie)[3].
• chaleur humide :
  • autoclave : son principe est de faire bouillir de l'eau dans une enceinte hermétiquement close pour augmenter la pression et donc dépasser les 100 °C d'ébullition (principe de l'autocuiseur). Ceci est réalisé à 134 °C pendant dix-huit minutes.

La pasteurisation est un procédé pour la conservation des aliments par lequel un aliment est chauffé à une température définie pendant une période de temps définie avant d'être refroidi rapidement. Les températures de pasteurisation varient entre 70 °C et 85 °C. Cette technique ne détruit qu'une partie de la flore bactérienne. Ce n'est, en aucun cas, une technique de stérilisation.

La tyndallisation est une série de chauffages brefs à des températures de 70 °C à intervalles réguliers (trois chauffages d'une heure, vingt-quatre heures entre deux chauffages), ceci afin de laisser aux formes résistantes la possibilité de germer pour les tuer au chauffage suivant. Par exemple, la destruction des germes pathogènes du lait se fait par un cycle de 63 °C pendant trente minutes suivie de 73 °C pendant quinze minutes.

L'ébullition n'est pas une méthode de stérilisation. Les formes sporulées des bactéries peuvent résister jusqu'à huit heures trente à 100 °C.

La filtration est une technique qui consiste à faire passer un liquide à travers un filtre dont les pores ont un diamètre de 0,2 μm ; les micro-organismes sont trop gros pour passer et sont donc retenus par le filtre. Pour forcer ce liquide à traverser le filtre on utilise deux solutions :

• mise en pression du liquide par l'intermédiaire d'un piston ;
• aspiration du liquide en créant par exemple une enceinte dépressurisée de l'autre côté du filtre.

Cette technique est intéressante lors d'utilisation de produits thermolabiles (c'est-à-dire qui ne résistent pas à la chaleur) comme certains acides aminés aromatiques, vitamines, hormones de croissance, acides nucléiques et une bonne partie des antibiotiques. Cependant les filtres de 0,2 μm colmatent vite. On peut contourner ce problème en augmentant la surface du filtre ou en utilisant un procédé de filtration tangentielle.

Dans certains cas le filtre ayant servi à stopper les micro-organismes peut être déposé sur un milieu de culture solide afin de permettre la multiplication des germes, ceci dans le but de procéder à leur dénombrement et à leur identification.

Ces techniques sont utilisées par les industries dont l'alimentaire. Elles sont très pénétrantes, car les radiations et certains gaz traversent le plastique et tuent les micro-organismes.

Les rayons ultraviolets ne sont cependant pas une bonne technique de stérilisation, car ils sont non pénétrants, donc ils ne passent pas au travers de matériaux comme le plastique et le verre. De plus certains micro-organismes sont capables de réparer les dommages infligés par les ultraviolets si le produit est éclairé après application de rayons ultraviolets ; c'est le phénomène dit « de photo-réparation ».

On peut dans certains cas utiliser le rayonnement gamma, beaucoup plus pénétrant et puissant que les ultraviolets.

Elle est basée sur la notion d'UFC (unité formant une colonie). Chaque unité cellulaire (une cellule, un groupe de cellules ou un morceau d'hyphe) va donner une colonie.

Sur un milieu de culture, il y a formation d'un monticule de bactéries ou de levures avec une forme particulière (la colonie). La forme de ce monticule est déterminée par l'organisation de la colonie, qui elle-même est déterminée génétiquement. Les champignons vont, eux, développer un thalle c'est-à-dire ce que l'on peut par exemple observer sur les confitures ayant « moisi. L'UFC est utilisée aussi pour le dénombrement bactérien en utilisant des cultures sur boîte à partir de tubes préparés par dilutions en cascades de la suspension bactérienne mère.

L'observation macroscopique de l'aspect des colonies permet de différencier les colonies de bactéries contaminantes de celles qu'on cherche à isoler.

Cette technique sert à évaluer le nombre de micro-organismes qui se trouvent dans un milieu liquide (eau de puits, boissons, eau de piscine, etc.) ou dans un milieu solide (sol, aliments, etc.). Elle peut aussi servir à isoler une souche pure à partir d'un mélange.

Il s'agit simplement d'une suite de dilutions suivie d'un prélèvement d'un aliquot qui sera étalé sur un milieu de culture qui pourra être sélectif ou non. Il suffira ensuite de compter le nombre de colonies, et connaissant le volume de l'aliquot (en général un millilitre sur une boîte), on en déduira la quantité approximative de bactéries dans le milieu (on considère qu'un UFC correspond à une bactérie).

L’étude de la morphologie bactérienne est le premier acte effectué par un laboratoire de diagnostic pour identifier une bactérie. L'observation de la morphologie bactérienne permet une orientation préliminaire du diagnostic.

À l'œil nu, on peut distinguer les caractéristiques d'une colonie :

• la forme du relief (bombée, semi-bombée, plate) ;
• la taille ;
• la couleur ;
• l'aspect (collant, filamenteux, etc.) ;
• l'odeur ;
• la transparence (opaque, translucide) ;
• l'allure des contours (régulier, dentelés) ;
• la consistance ;
• la pigmentation ;
• aspect de la surface (lisse ou rugueuse).

Il existe trois grands types de colonies :

• colonies de Type S (Smooth = lisse) : contours lisse et réguliers, semi-bombée, surface brillantes, crémeuses ;
• colonies de Type M (Muqueux) : contours lisse et réguliers, très bombées, surface très brillantes, filantes ;
• colonies de Type R (Rough = rugueux) : contours irréguliers, plates rugueuses et mates, sèches.

L'état frais se fera avec une suspension de colonie qui ne sera pas fixée sur la lame comme la coloration de gram mais se fera avec une goutte de suspension entre lame et lamelle. Cette observation microscopique se fera à l'objectif x40 avec peu de lumière pour ne pas tuer les bactéries car le but de cette observation est de voir leurs mobilités (on peut voir aussi la morphologie mais cela se voit mieux en coloration de gram).

Les bactéries étant en général quasiment transparentes, on commence par préparer un étalement (faire un frottis) sur lame de microscope auquel on applique une coloration de Gram. L'observation microscopique se fera à l'objectif x100 avec de l'huile à immersion. Les bactéries à Gram positif apparaîtront mauves alors que celles à Gram négatif apparaîtront roses. Il existe d'autres colorations, comme celle au vert de malachite permettant de mettre en évidence les formes sporulées. La coloration de Gram permet de déterminer le type de paroi cellulaire.

La forme est extrêmement diverse au sein du monde bactérien. Si on excepte les bactéries dépourvues de paroi (Mycoplasmes), qui peuvent être très polymorphes, la diversité est relativement restreinte pour les bactéries d’intérêt médical et vétérinaire. Parmi celles-ci, on distingue principalement des formes sphériques (cocci), cylindriques (bacille), spiralées (spirille), enroulées (spirochète) à appendice bourgeonnant ou filamenteux.

Elles peuvent se regrouper en chaînes (Streptococcus, Enterococcus, Lactococcus, etc.), en amas asymétriques ou grappes (Staphylococcus), en amas cubiques réguliers (sarcines), en palissades ou en paquets d’épingles (Corynebacterium), etc. Le mode de groupement, à condition de l’apprécier sur une culture jeune effectuée en milieu liquide et de tenir compte de l’aspect prédominant, est également un élément important pour orienter l'identification.

Les plus petites bactéries ont une taille de 0,1 à 0,2 μm (Chlamydia) alors que certaines ont un diamètre supérieur à 10 μm. La plus grande bactérie connue (Thiomargarita namibiensis) peut atteindre un diamètre de 750 μm.

Toutes les bactéries n'ont pas la possibilité de sporuler. La totalité des bacilles à Gram + sporulent en situation de stress.^[pas clair] Pour mettre en évidence les spores au microscope optique, il suffit de les colorer au vert de malachite ou à l'encre de Chine. Mais on peut les deviner à la coloration de Gram (absence de coloration). Les spores sont présents chez les Bacillus.

Les bactéries peuvent être équipées d'un ou plusieurs flagelle(s) leur permettant de se déplacer. Les deux mobilités les plus courantes sont la mobilité par ciliature péritriche si la bactérie se déplace dans tous les sens, soit par ciliature polaire si la bactérie part dans un seul sens. Pour définir le mode de déplacement des bactéries, on parle de chimiotactisme. La bactérie évoluant dans un milieu se déplace selon des gradients de concentration pour se rapprocher de sa « nourriture »

La capsule est formée de polymères (polysaccharides ou protides) disposés en couches à la périphérie de la bactérie. Celle-ci permet à la bactérie d'adhérer aux surfaces (coloniser les surfaces) et d'échapper au système immunitaire car les antigènes de surface sont recouverts par la capsule qui les rend indétectables (pouvoir pathogène).

On identifie aussi une bactérie en observant si elle utilise tel ou tel substrat. On la met donc en contact dans un milieu de culture avec un glucide, ou un peptide, ou d'autres substrats plus complexes — le test de l'oxydase par exemple utilise le tétraméthyl-paraphénylènediamine. On peut révéler l'utilisation de ce substrat par virage d'un indicateur de pH car un glucide utilisé donne un produit acide, un peptide donne un produit basique, etc.

Chaque famille de bactéries a des caractères propres, on peut donc les rassembler facilement avec des caractéristiques de base comme l'utilisation du glucose avec ou sans oxygène, la réduction des nitrates, etc. Ensuite, on dispose de galeries d'identifications biochimiques qui sont parfois vendues par des sociétés spécialisées. Ces tests sont assez longs, de un à deux jours.

On peut citer des techniques de génie génétique comme :

• la PCR (Polymerase Chain Reaction) pour cibler un gène présent uniquement chez une famille ou un genre bactérien par réhybridation spécifique de courtes séquences d'ADN (oligonucléotides amorces) synthétiques précises ;
• les puces à ADN qui utilisent le même principe mais ayant une précision allant jusqu'à la souche même.

La systématique permet d'identifier une souche bactérienne inconnue grâce à différents examens et à l'utilisation de milieux de culture spécifiques.

La coloration de Gram et les tests de la catalase et de l'oxydase permettent de déterminer la famille. Des milieux de cultures spécifiques permettent d'arriver au genre et à l'espèce. Des examens supplémentaires tels que le sérogroupage peuvent être utilisés dans certains cas.

• Famille des Micrococcaceae
  • Genre Micrococcus
• Famille des Staphylococcaceae
  • Genre Staphylococcus

• Famille des Streptococcaceae
  • Streptocoques des groupes Lancefield A, B, C, D (Enterococcus), F et G

Gram négatif regroupe les bactéries à paroi fine qui ne retiennent pas le bleu de gentiane/cristal. Elles apparaissent au microscope optique en rose après que l'on ajoute de la fuchsine (genre neisseria, par exemple).

• Genre Bacillus
• Genre Listeria
• Genre Clostridium

Famille des Enterobacteriaceae :

• Genre des Salmonella
• Genre des Escherichia
  • Sérogroupage des Escherichiae Coli
  • Sérogroupage des autres Escherichia
• Genre Shigella
• Genre Klebsiella
• Genre Enterobacter
• Genre Serratia
• Genre Proteus
• Genre Morganella
• Genre Providencia
• Genre Hafnia

• Pseudomonas
• Vibrio
• Aeromonas

On peut citer les agents suivants :

• la chaleur : à partir de 65 °C, les protéines sont dénaturées, cependant certains micro-organismes sont capables de supporter des températures plus élevées ;
• le pH : qu'il soit trop acide ou trop basique ;
• les hautes pressions : à partir de 6 000 bar. Ainsi, c'est avec un traitement par la pression que l'on stérilise les jus de fruits produits en industrie ;
• les UV : à une longueur d'onde voisine de 260 nm, ils détruisent tous les micro-organismes. Peu efficaces à travers les plastiques, ils sont utilisés pour stériliser l'air ;
• les rayons gamma : comme les UV, ils sont très efficaces. Ils peuvent traverser tous les plastiques et servent donc à stériliser les instruments comme les fils chirurgicaux. Leur utilisation a été tentée pour les produits alimentaires, sans succès auprès du public.

Les agents chimiques utilisés se répartissent dans deux catégories : antiseptiques et désinfectants. Les antiseptiques sont utilisés pour l'élimination des micro-organismes sur des tissus vivants ; les désinfectants quant à eux sont utilisés sur des surfaces inertes.

Figure 4 : courbe de croissance dans un milieu contenant deux glucides (par exemple : I : utilisation du glucose et II : utilisation du lactose).

En présence de deux sources de carbone, les bactéries exhibent une courbe de croissance biphasique. Ceci s'explique par la consommation de la source de carbone la plus facilement assimilable, puis une adaptation pendant laquelle les enzymes permettant de dégrader la deuxième source de carbone sont synthétisées, puis consommation de la deuxième source de carbone (c'est le cas par exemple du milieu Kligler-Hajna. Sur ce milieu, la bactérie utilise le glucose comme première source de carbone puis le lactose comme second source de carbone lorsqu'il n'y a plus de glucose). L'analyse de ce comportement a permis à Jacques Monod de définir la notion d'opéron ; le plus connu étant l'opéron lactose.

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