Immunohistochimie

L'immunohistochimie est largement utilisée pour le diagnostic et/ou le suivi de cancers par détection de cellules anormales telles que celles trouvées dans les tumeurs cancéreuses. Des marqueurs spécifiques sont ainsi aujourd'hui connus pour divers cancers ;

• Antigène carcino-embryonnaire (CEA) : utilisé en cas de cancer du côlon
• CD15 et CD30 : utilisés pour la maladie de Hodgkin
• Alpha-fœtoprotéine : en cas de carcinome hépatocellulaire
• CD117 : en cas de tumeur stromale gastro-intestinale
• Ki-67 : un des indices de prolifération tumorale.

Ces marqueurs moléculaires sont caractéristiques de certains événements cellulaires tels que la prolifération ou la mort cellulaire (apoptose).
L'IHC est aussi largement utilisée en recherche fondamentale pour comprendre la distribution et la localisation de biomarqueurs et de protéines différentiellement exprimés dans les différentes parties d'un tissu biologique.

Le tissu est placé sur un support solide. L'anticorps est ajouté à la préparation de tissu, fixant spécifiquement la protéine à détecter sur ce tissu. L'ajout d'un anticorps primaire lié à un système de détection (enzyme liée à l'anticorps, dont la mise en présence du substrat provoque une réaction colorée (peroxydase) ou fluorescente (Rhodamine)), provoquant un signal visible à l'œil nu, ou par des techniques de microscopie et de spectrophotométrie.

Il existe principalement deux méthodes concernant l'immunohistochimie et la détection d'antigènes au sein des tissus biologiques :

• La méthode directe
• La méthode indirecte

Texte à traduire

Portion de texte anglais à traduire en français

Texte anglais à traduire :
The "direct method" is a one-step staining method, and involves a labeled antibody (i.e. FITC conjugated antiserum) reacting directly with the antigen in tissue sections. This technique utilizes only one antibody and the procedure is therefore short and quick. However, it is insensitive due to little signal amplification and rarely used since the introduction of the indirect method.

The "indirect method" involves an unlabeled primary antibody (first layer) which reacts with tissue antigen, and a labeled secondary antibody (second layer) which reacts with the primary antibody. (The secondary antibody must be against the IgG of the animal species in which the primary antibody has been raised.) This method is more sensitive due to signal amplification through several secondary antibody reactions with different antigenic sites on the primary antibody. The second layer antibody can be labeled with a fluorescent dye such as FITC, rhodamine or Texas red, and this is called the indirect immunofluorescence method. The second layer antibody may be labeled with an enzyme such as peroxidase, alkaline phosphatase or glucose oxidase, and this is called the indirect immunoenzyme method. Offering a substrate to these enzymes will demonstrate presence of the enzyme (and hence the antibody) in a quantifiable fashion.

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Protocole : Mise au point de l’anticorps PEA3

L’anticorps PEA3 est utilisé pour rechercher la protéine ETV4 qui est exprimé en grand nombre dans le sarcome à cellules rondes d’Ewing.

Le sarcome à cellules rondes d’Ewing est un cancer très agressif qui s’attaque principalement aux os et aux tissus mous chez des personnes assez jeunes. Il est lié à une translocation* au niveau des gènes CIC – DUX4, ce qui va produire une surexpression de la protéine ETV4.

PEA3 est un anticorps de souris monoclonal*. (C’est-à-dire que l’on a injecté à la souris, l’antigène humain que l’on recherche (ETV4) dans le sarcome à cellules rondes d’Ewing, pour créer une réaction immunitaire chez la souris et pour qu’elle puisse produire les anticorps qui vont nous servir pour l’immunohistochimie.)

•Lecture de la fiche technique :

- Espèce chez laquelle est fabriqué l’anticorps (Source/Purification)

- Stockage (Frigo/Congélateur

- Lot (aliquote* ou pas)

- Volume d’anticorps disponible

- Dilution (Soit proposé dans la fiche technique, soit se rapporter à un article publié)

•Réhydratation :

(Tout d’abord, pour réaliser une réaction antigène/anticorps, il faut réhydrater les tissus paraffinés sur la lame. Donc faire les étapes inverse où l’on met le tissu dans de la paraffine.)

1) 4 min dans chaque bain :

- Xylène* (3 bains)

- Alcool absolu (2 bains)

-  Alcool 90°C (1 bain)

-  Alcool 70°C (1 bain)

2) Plonger la lame immédiatement dans un récipient d’eau (pour que les tissus réhydratés ne sèchent pas), et faire rincer pendant 3 min en faisant coulé l’eau du robinet dans le récipient.

3) Plonger la lame dans un récipient d’eau distillée

•Prétraitement :

1) Diluer le pH9 au 1/10 (50 ml de tampon + 500 ml d’eau distillée) dans une éprouvette de 500 ml. Mettre la lame dans le pH9 dilué.

2) Faire chauffer au micro-onde « programmé sur vapeur », la lame dans le pH9 dilué, pendant 30 min en ne fermant pas totalement le bocal (pour que la vapeur puisse s’échappée).

3) Attendre que la solution pH9 dans le bocal refroidisse pendant 20 min.

4) Rincer la lame dans un récipient d’eau pendant 3 min.

5) Faire une délimitation des tissus, à l’aide d’un marqueur hydrophobe.

6) Déposer de H2O2 (permet de neutraliser les peroxydases endogènes (dans le tissu) en vue de la coloration au DAB [peroxydases oxydent DAB produit coloré]) jusqu’à remplir le cadrant de délimitation et laisser reposer 10 min dans une chambre humide (car anticorps PEA3 agit de nuit).

7) Pendant ce temps faire une dilution adaptée de l’anticorps PEA3.

8) Rincer la lame dans un récipient d’eau.

9) Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.

10) Faire tremper la lame dans un récipient contenant un tampon de réaction (tampon de lavage qui permet à l’anticorps de mieux se répartir sur la lame car il a un effet «mouillant») pendant 5 min.

11) Déposer l’anticorps (permet la fixation spécifique de l’anticorps (de souris) sur la protéine ETV4 [marquage nucléaire]) dans le cadrant de délimitation à l’aide d’une pipette et faire reposer la nuit au frigo.

•Révélation :

1) Rincer la lame avec du tampon de réaction.

2) Laisser la lame 3 min dans un récipient contenant du tampon de réaction.

3) Mettre l’anticorps de chèvre Rabbit/Mouse (cette chaîne de dextranes  sur laquelle est couplée à l’anticorps de chèvre anti lapin/souris et est fixée un grand nombre de peroxydase, permet la fixation d'anticorps de chèvre sur les anticorps de souris [amplifie le signal donne une meilleure vue à l’observation microscopique]) pendant 30 min.

4) Rincer avec du tampon de réaction.

5) Laisser la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction.

6) Préparer la dilution de la DAB (1 ml de tampon DAB + 1 goutte de DAB) à l’aide d’une pipette compte-goutte.

7) Mettre la révélation à la DAB (révélation de l’anticorps secondaire, par l’action enzymatique des peroxydases + DAB [produit coloré], donc localisé là où la protéine ETV4 est fixée sur l’anticorps primaire) sur le cadrant de délimitation et laisser reposer 8 min dans une boite hydratée cachée de la lumière.

8) Rincer la lame dans un récipient d’eau.

9) Mettre la lame dans un récipient d’eau distillée.

•Contre-coloration

1) Plonger la lame pendant 5 à 10 secondes (si le tissu est grand) ou moins dans de l’hématoxyline (permet de colorer les noyaux/cytoplasme/membranes qui ne sont pas relevés par l’anticorps).

2) Rincer à l’eau jusqu’à ce que le colorant parte.

3) Mettre la lame dans un récipient contenant du tampon de réaction (virage bleu des noyaux/cytoplasme/membranes) pendant 2 min.

4) Déshydrater (Alcool 70°C Alcool 90°C Alcool absolu [x2] Xylène [x3]) et monter sous lamelle

Articles connexes

Liens externes

Bibliographie