Histologie

Les prélèvements, quels qu'ils soient doivent être effectués avec le plus grand soin, car leur qualité conditionne directement les possibilités d'étude.

• Pour les tissus végétaux, le prélèvement utilise des méthodes particulières (écrasement, empreinte par vernis, etc.)
• Pour des tissus animaux (et notamment humains), on distingue quatre catégories majeures de prélèvement :
  • les frottis : prélèvement médical au moyen d'un écouvillon stérile, d'une petite brosse ou d'une petite spatule (par exemple au niveau du col de l'utérus) ;
  • les biopsies : prélèvement de très petite taille d'un tissu, à des fins d'étude microscopique ;
  • les résections d'organes en intégralité, suivies de leur étude (dans le cas d'une tumeur, déterminer le caractère bénin ou malin par exemple) ;
  • les ponctions de liquides (pleurale, ascitique, péricardique, etc.)

Il existe également des techniques de prélèvement plus sophistiquées : par excision, microdissection. Des prélèvements sont fréquemment réalisés au cours d'une opération, et sont étudiés directement au bloc opératoire en extemporané par cryostat.

Afin de conserver l'échantillon dans un état le plus proche possible de l'état in vivo, deux moyens de conservation peuvent être utilisés :

• La congélation, utilisée pour les prélèvements en salle d'opération dont le diagnostic doit être connu rapidement (examen extemporané);
• La fixation par un produit chimique comme le formol ou le liquide de Bouin), qui a pour effet de polymériser les protéines et, dans certains cas, les lipides présents dans l'organe. Cette technique est utilisée pour les coupes histologiques "longues durées" après inclusion en paraffine.

Inclusion d'un bloc en OCT (Optimal Cutting Temperature compound). Cette méthode permet de durcir les échantillons à -20°C tout en conservant les ultrastructures cellulaires et nucléaires. On la préconise pour faire des manipulations d'immunohistochimie et d'hybridation in situ. [3]

Les organes, trop gros pour laisser passer la lumière nécessaire à la microscopie optique, doivent encore être découpés en lamelles extrêmement fines par un appareil appelé microtome. Pour cela, on les enrobe dans de la paraffine ou une résine, selon l'épaisseur souhaitée de la coupe. On distingue plusieurs types de coupe selon la méthode de conservation et d'amincissement suivie :

Les coupes de 0,05 μm seront analysées en microscopie électronique tandis que les autres seront observées en microscopie optique.

Exemple de coloration en microscopie optique: Coloration au Carmin d'un Monogène (ver parasite)

Les tissus biologiques présentent en eux-mêmes très peu de contraste, aussi bien en microscopie optique qu’en microscopie électronique. La coloration est utilisée aussi bien pour augmenter le contraste que pour mettre en valeur l’une ou l’autre structure en particulier.

De nombreuses techniques de coloration ont été découvertes de façon fortuite. Dans un certain nombre de cas, le lien spécifique entre la coloration et la nature du tissu n’est toujours pas connu actuellement (charges ioniques des molécules du colorant, taille des molécules du colorant ?). Parmi ces techniques, on peut citer les trichomes et la méthode de Van Gieson (hématoxiline ferrique, acide picrique, fuchsine acide).

On parle d’histochimie quand la coloration se fonde sur des réactions chimiques connues entre des réactifs de laboratoire et des composants des tissus étudiés. Par exemple lors d’une coloration à l’hématoxiline-éosine, l’éosine qui est un acide se fixe préférentiellement aux molécules basiques et permet donc de colorer le cytoplasme cellulaire (végétal ou animal), alors que l’hématoxiline, qui est une base, colore les noyaux cellulaires en se fixant préférentiellement aux acides nucléiques. La coloration par le Periodic Acid-Shiff (PAS) permet de colorer de nombreux glucides par rupture des ponts Carbone-Carbone des 1,2-glycols par l’acide périodique qui est un agent oxydant. La rupture de ces ponts produit des dialdéhydes qui réagissent avec le réactif de Shiff (fuchsine, acide sulfurique) pour donner un composé magenta vif.

La distribution tissulaire de certaines enzymes spécifiques peut-être étudiée sur des coupes fraîches en y ajoutant un substrat spécifique de cet enzyme. L’enzyme réagit alors avec ce substrat pour former un produit de réaction primaire, insoluble et pouvant être mis en évidence par une coloration appliquée d’emblée ou dans un second temps. La plupart des systèmes enzymatiques étant détruits lors de la fixation, les méthodes d’histochimie enzymatique sont le plus souvent réalisées sur coupes en congélation. Ces techniques permettent de détecter un grand nombre d’enzymes s’exprimant de façon pathologique dans certains tissus.

Les échantillons de tissus peuvent être colorés par des techniques radiographiques. Les deux usages les plus courants sont le marquage des cellules en phase S de la mitose par incorporation lors de la réplication de l'ADN de thymidine tritiée et l’hybridation in-situ. Le marquage peut être révélé par visualisation sur microscope à fond noir des grains d’argents formés par réaction du rayonnement radioactif sur une plaque photographique. Cette technique tend à être remplacée par l’immunohistochimie.

Des anticorps spécifiques sont utilisés pour venir se fixer à une molécule de la coupe histologique. Ces anticorps polyclonaux, produits chez l’animal à partir de la protéine purifiée, seront porteurs d’un marqueur, le plus souvent fluorescent. On parle alors d’immunofluorescence. Cette technique tend à faire disparaître l’historadiographie. Les échantillons sont alors examinés sous microscope à fluorescence.

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