Chromatographie en phase liquide

Dans cette chromatographie, la phase stationnaire consiste en une matière solide à grand pouvoir d'adsorption, tel que l'oxyde d'aluminium, les silicates de magnésium, les gels de silice. Les composants sont simplement plus ou moins retenus à la surface de la phase stationnaire par adsorption physique. C'est une technique qui prend en compte la polarité des composants.

Dans cette chromatographie les analytes sont séparés en fonction de leur affinité avec les phases stationnaire et mobile. L'affinité dépend de la polarité des analytes et des phases. En mode normal la phase stationnaire est polaire, en mode inverse elle est apolaire. Il y a deux types de chromatographie de partage :

• liquide - liquide : la phase stationnaire consiste en une très fine couche de liquide répartie par adsorption physique à la surface du matériau support le plus inerte possible. Les composants sont séparés comme dans une extraction liquide-liquide, sauf que la répartition des composants se fait lors du passage dans la phase liquide et non par agitation.
• liquide - solide ou liquide - phase greffée : la phase stationnaire consiste en une espèce organique liée par des liaisons chimiques à la surface des particules du matériau support.

La phase solide est une résine insoluble munie de groupes fonctionnels capable de se dissocier. Ce sont, habituellement, des groupes "acide sulfonique" (SO₃H) pour les échangeurs de cations et "ammonium quaternaire" (N(R)₃) pour les échangeurs d'anions.

Appelée aussi chromatographie à perméation de gel, cette technique consiste en séparer les composants selon leur dimension moléculaire. La phase stationnaire est composée d'un matériau poreux (petites particules de silice ou de polymères), les molécules dont le diamètre est supérieur à celui des pores ne peuvent pénétrer et ne sont pas retenues. La durée de séjour dans la colonne augmente lorsque la taille des analytes diminue.

La chromatographie de paires d’ions (en anglais ion pair chromatography) est utilisée pour séparer et analyser des ions. Ces ions forment une paires d’ions à l’aide d’un contre-ion qui possède une ou des chaînes alkyles. Par la présence de ces chaînes alkyles, le contre-ion a une affinité avec les molécules hydrophobes. Ces contre-ions sont généralement du tétraalkylammonium pour des analytes à charge négative (acides) ou de l’alkylsufonate pour des analytes à charge positive (bases). La longueur de chaîne l’alkyle est importante en chromatographie de paires d’ions. Elles influencent le ratio de contre-ions dans la phase stationnaire versus la phase mobile. La concentration en contre-ions est plus importante si la chaîne alkyle est plus longue, ceci peut être expliqué par le fait que le caractère hydrophobe du contre-ion et de la paire d’ions est plus grand lorsque la chaîne alkyle est longue, donc le contre-ion se liera plus facilement à la phase stationnaire [1].

Il existe donc deux types de chromatographie de paires d’ions :

• Chromatographie de paires d’ions cationique : Elle est utilisée pour séparer les espèces ioniques chargées négativement, comme les bases par exemple.
• Chromatographie de paires d’ions anionique : Elle est utilisée pour séparer les espèces ioniques chargées positivement, comme les acides ou les sels par exemple.

La phase stationnaire(ou solide) est composée de silice greffée par des chaînes alkyles. La phase stationnaire est alors apolaire, ce qui ne retient aucunement les ions qui ne possèdent pas de zone apolaire et c’est pourquoi la présence de contre-ions apolaire est nécessaire pour la rétention de l’analyte. Par contre, il est possible que l’analyte possède une chaîne alkyle, ce qui permet à l’analyte à être retenu, mais pour augmenter leur rétention il est avantageux d’ajouter le contre-ion, puisque le contre-ion peut avoir une meilleure affinité avec la phase stationnaire, ce qui permet une meilleure séparation.

La phase mobile est généralement composée d’un mélange d’eau (solvant A) et d’acétonitrile ou de méthanol (solvant B). La phase mobile contient aussi le contre-ion utilisé. Le pourcentage volumique en acétonitrile ou en méthanol dans la phase mobile (%B) est importante, parce qu’elle influence la solubilité du contre-ion. Plus la concentration du solvant B (acétonitrile ou méthanol) est élevé, plus le contre-ion sera présent dans la phase mobile, donc il sera moins présent dans la phase stationnaire. En addition, la longueur de la chaîne carbonée fait augmenter la concentration de celui-ci dans la phase stationnaire, donc plus la longueur de la chaîne est grande moins le contre-ion sera présent dans la phase mobile. De plus, le type de chromatographie doit être aussi tamponné. En effet, la préparation de la phase mobile doit être à pH contrôlé.

La concentration du contre-ion a une influence directe sur le facteur de rétention k du soluté. Plus la concentration du contre-ion augmente, plus le facteur de rétention k augmente. L’agencement de la molécule a une influence sur la rétention, plus la chaîne alkyle est substituée et plus le caractère hydrophobe de la molécule est important et donc la rétention augmente. La longueur de la chaine carbonée agit aussi sur le facteur de rétention. Le facteur k peut être modifié en agissant sur la composition de la phase mobile, c’est-à-dire en agissant directement sur la fraction volumique du contre ion dans le solvant.

Le pH permet aux molécules d’être complètement ionisées, ce qui fait que le pH est un facteur très important pour effectuer une chromatographie de paires d’ions. En ce qui concerne les acides, le pH de la solution doit être supérieur ou égale au pKA+2 du couple A-/HA et cela permet à cette espèce d’être à 99% sous forme d’anion. Tandis que pour les bases le pH doit être inférieur ou égale au pKA-2 du couple HB+/B (dans cette section B représente une base), ce qui fait un ratio de 99:1 de HB+ par rapport à B. Pour ce faire l’éluant est tamponné à l’aide d’un acide ou d’une base qui ne réagit pas avec la silice ou l’analyte.

En chromatographie de paires d’ions, des ions secondaires peuvent se former lors de l’augmentation de la force ionique et donc réduit la formation des paires d’ions que l’on veut former. On peut en conclure que la rétention diminue avec l’augmentation de la force ionique.

Un avantage de cette technique est qu’il est possible d’analyser des espèces neutres en même temps que des espèces ioniques puisque la méthode expérimentale de cette chromatographie est similaire à celle de la chromatographie liquide inverse. Cette technique permet d’augmenter le temps de rétention pour les molécules ioniques, donc il est possible d’avoir une meilleure résolution entre deux molécules, surtout lorsqu’il est possible d’en avoir une seule ionique. Un des inconvénients majeurs est que la silice greffée ne peut pas être utilisé à un pH supérieur à 7,5, donc cela détermine la limite de la chromatographie par paires d’ions.