Microscopie STED

Le microscope STED est basé sur un microscope à fluorescence confocal à balayage. Pour mieux comprendre le principe du STED, il est utile de réviser les principes de fluorescence, émission stimulée et microscopie confocale.

Pour marquer les structures d'intérêt dans les échantillons qu'on veut observer avec la microscopie STED on utilise des colorants fluorescents ou fluorophores, « excités » à une certaine longueur d'onde: par absorption d'un photon ils sont transférés dans un état plus énergétique. Ils retournent à l’état fondamental par émission spontanée d'un autre photon de longueur d'onde plus large (lumière d'une autre couleur) : c'est la lumière de fluorescence qui rend les structures d'intérêt visibles.

Un fluorophore excité peut également retourner par un autre procédé : l'émission stimulée. Un photon illuminant un fluorophore excité provoque le retour de ce fluorophore à l'état fondamental et l'émission d'un photon, identique au photon d'illumination. L'émission spontanée ne peut donc plus avoir lieu, car le fluorophore n'est plus dans l'état excité. La lumière de fluorescence n'est alors pas observée : ce procédé permet donc d'« éteindre » la fluorescence par émission stimulée. La lumière de fluorescence spontanée et la lumière émise par émission stimulée peuvent être séparées, par exemple par des filtres colorés.

Dans un microscope à balayage laser, l'illumination n'est pas plein champ : l’échantillon est balayé par un faisceau laser focalisé en un petit point dans l’échantillon. La fluorescence de ce point est détectée. Par balayage du point focal, une image est construite point par point. La taille du point focal détermine la finesse des détails qui peuvent être résolus. À cause de la diffraction, la taille du point focal est limitée à un rayon minimum. Il est impossible de focaliser un laser sur un point plus petit qu’à peu près la moitié de la longueur d’onde.

Le moyen sans doute le plus direct pour affiner le point focal de fluorescence est d'inhiber sélectivement la fluorescence dans ses parties extérieures. Si ceci est appliqué à un faisceau limité par la diffraction, on peut s'attendre à ce que la barrière de diffraction soit dépassée puisqu'un point focal plus petit signifie résolution spatiale augmentée.

Principe de la microscopie STED. À gauche : profil transverse du faisceau d'excitation. Au centre : faisceau de désexcitation. À droite : fluorescence résultante.

Dans ce but l’échantillon n’est pas seulement illuminé avec le faisceau d’excitation focalisé (figure de gauche) mais aussi avec un faisceau STED" (impulsion de déplétion) auquel on donne le profil d’un anneau dans l’échantillon (figure du milieu). La longueur d’onde de ce faisceau est choisie de façon qu’il induise l’émission stimulée. Au centre, là où le faisceau d’excitation a son intensité maximale, l'intensité du faisceau STED est minimum et n’y influence pas les fluorophores qui restent lumineux (figure de droite). Par contre, il éteint les fluorophores périphériques par émission stimulée.

L'émission stimulée est donc l'une des clés du STED. Cependant, le STED par lui-même ne pourrait vraiment dépasser la limite de diffraction puisque les faisceaux avec lesquels travaille le STED sont eux-mêmes limités par la diffraction. Le point crucial pour dépasser cette limite de diffraction réside dans le lien non linéaire entre la fluorescence et l'excitation (saturation de l'inhibition de fluorescence). La taille de la tache lumineuse résultante diminue avec l’augmentation de l’intensité du faisceau STED, ce qui améliore la résolution; la résolution atteignable est théoriquement illimitée[3].