Cytogénétique

Après les premières observations de chromosomes en 1880 par Flemming, la génétique est longtemps restée une science marginale, c'est pourquoi ce n'est qu'en 1956 que le nombre de chromosomes de l'espèce humaine a été correctement établi à 46 par Tjio et Levan, à partir de cultures de tissus, et en ayant eu l'idée d'introduire le choc hypotonique pour améliorer l'étalement des chromosomes. Les techniques utilisées aujourd'hui pour l'établissement du caryotype classique n'ont que peu évolué par rapport à cette période. En 1959, a été décrite par Jérôme Lejeune et ses collaborateurs la première anomalie chromosomique liée à une pathologie, la trisomie 21. Elle a été suivie, la même année, par la description par Jacobs et Strong de la première anomalie des chromosomes sexuels, avec une formule XXY, dans le syndrome de Klinefelter. En 1960, a été établie à Denver la première nomenclature internationale pour la classification des chromosomes, basée sur leur taille et la position de leur centromère. Les causes des syndromes malformatifs chromosomiques les plus fréquentes ont été découvertes très rapidement ensuite: syndrome de Turner, trisomies 13 et 18... En 1960, a été identifiée aussi, par Nowell et Hungerford, la première anomalie chromosomique dans une affection maligne, donc acquise, le chromosome de Philadelphie, initialement décrit comme un 22 délété, dont Rowley a démontré par la suite qu'il était le résultat d'une translocation t(9;22).

L'analyse des chromosomes par des techniques de cytogénétiques résulte en général d'analyses précédemment réalisées et montrant un risque pour certaines maladies. La première technique de cytogénétique est la réalisation de caryotypes, dont les chromosomes sont le plus souvent colorés avec le colorant G. Est ensuite apparue la FISH (voir ci-dessous), permettant une bien meilleure résolution dans un temps plus court. Enfin, récemment est apparue l'hybridation comparative ou aCGH pour array Comparative Genomic Hybridization.

Interphase cells positive for a t(9;22) rearrangement

La technique dite de FISH (Fluorescent In Situ Hybridization) est une technique qui permet de révéler par fluorescence grâce à des sondes d'ADN des séquences sur les chromosomes. Cela permet d'identifier des anomalies chromosomiques lors d'analyses pré- et post-natales. Chaque analyse ne permet d'identifier qu'une seule anomalie, et c'est une technique ciblée, les sondes utilisées ne sont pas choisies au hasard, mais font suite à de précédentes analyses (de biochimie en général).

Les cellules à étudier subissent un choc hypotonique (dans une solution saline par exemple), qui provoque une entrée d'eau dans la cellule. La cellule ainsi gonflée est fragilisée. On prélève une goutte de solution qu'on laisse tomber sur une lame. Le choc rompt la membrane plasmique des cellules, libérant noyau (pour les cellules en interphase) et chromosomes (pour les cellules en mitose) sur la lame. Ces noyaux et chromosomes sont ensuite fixés sur la lame avec du méthanol (déshydrate et aplati les noyaux) ou du paraformaldéhyde (qui maintient la forme du noyau). Ces produits sont utilisés suivant ce que l'on cherche à observer dans le noyau. Leur utilisation est indifférente pour les chromosomes.

Une étape importante dans l'obtention de la lame est la digestion par une RNAse (une enzyme qui dégrade les ARN) des ARN libérés lors de l'éclatement de la cellule sur la lame. En effet ces ARN pourraient fixer des sondes marquées pendant l'étape d'hybridation, et donneraient du bruit lors de l'observation au microscope. On peut également faire une dégradation ménagée des protéines pour rendre plus accessible l'ADN génomique à nos sondes et aux anticorps (étape de révélation des sondes). Pour cela on utilise de la protéinase K ou de la Pepsine. Il faut cependant prendre garde à ne pas utiliser ces protéases à des concentrations trop élevées ou trop longtemps, car cela affecterait la forme des chromosomes qui seraient méconnaissables au microscope.

Les lames sont lues à l'aide d'un scanner de biopuces comme l'InnoScan 710 ou l'InnoScan 910 de la société Innopsys puis analysées avec des logiciels dédiés afin de faire la corrélation entre la fluorescence acquise et les éventuelles perturbations génétiques.