Spectrophotomètre

Selon la loi de Beer-Lambert, l'absorbance d'une solution est proportionnelle à la concentration des substances en solution, à condition de se placer à la longueur d'onde à laquelle la substance absorbe les rayons lumineux. C'est pourquoi la longueur d'onde est réglée en fonction de la substance dont on veut connaître la concentration.

• D'après la loi de Beer-Lambert, l'absorbance ${\displaystyle A_{\lambda }}$ est fonction de la concentration C de la solution, du coefficient d'absorption molaire ${\displaystyle \varepsilon _{\lambda }}$ et de la longueur de solution à traverser L[2].

${\displaystyle A_{\lambda }=-\log _{10}{\frac {I}{I_{0}}}=\varepsilon _{\lambda }\cdot \ell \cdot C}$

où ${\displaystyle {\frac {I}{I_{0}}}}$ est la transmittance de la solution.

• On remarque que ${\displaystyle A_{\lambda }}$ et ${\displaystyle \varepsilon _{\lambda }}$ sont fonction de la longueur d'onde de travail, elle est choisie en fonction des spectres d'absorbance.

Spectre d'absorbance de NAD⁺ et de NADH,H⁺ (wavelength=longueur d'onde)

Ici les deux spectres sont superposés, pour les réaliser indépendamment on a mesuré l'absorbance d'une solution de NAD⁺ (respectivement de NADH,H⁺) à différentes longueurs d'onde (toutes choses égales par ailleurs).

La longueur d'onde d'absorbance maximale est ici ${\displaystyle \lambda }$max=260 nm pour les deux molécules. Il sera donc préférable de travailler à cette longueur d'onde. En revanche, si on veut doser NADH,H⁺ lors d'une réaction enzymatique où le NAD⁺ est réduit en NADH,H⁺ par exemple, il est plus judicieux de travailler à ${\displaystyle \lambda }$=340 nm car ici on ne mesure que NADH,H⁺ car l'absorbance de NAD⁺ est nulle même s'il est présent dans le mélange.

Les spectromètres Infrarouge (IR) sont essentiellement utilisés pour l’identification. On peut dire que, pratiquement, les spectromètres UV-visible sont utilisés pour des analyses quantitatives alors que les spectromètres IR sont des instruments qualitatifs. Tous deux utilisent les principes optiques semblables, mais le spectromètre IR balaye en fréquence l’échantillon.

Galerie :

• 
  Spectromètre de laboratoire (capot ouvert).
• 
  Spectromètre de laboratoire (fermé).
• 
  Autre modèle.
• 
  Spectromètre portable pour mesurer la couleur (souvent exprimée dans le système L*a*b*) d'une surface.

Le spectromètre UV-visible (UV : ultraviolet) comprend :

• une source ou des sources de lumière : lumière blanche pour la mesure dans le spectre visible (lumière polychromatique) et/ou lumière UV.
  • La lampe UV est généralement de type deutérium (domaine de 195 à 380 nm, durée de vie de la lampe de 1 000 h, par exemple).
  • La lampe visible est généralement de type halogène (domaine de 320 à 1 000 nm, durée de vie de 500 h, par exemple).
  • Il existe également des spectromètres à lampe xénon ; (domaine de 190 à 1 100 nm)
• un monochromateur formé d'un réseau diffractant la lumière de la source. Il permet de sélectionner la longueur d'onde de la lumière qui traversera la solution à doser ;
• une fente de largeur fixe ou variable pour régler la bande passante ;
• un porte-cuvette pouvant permettre le maintien à température souhaitée de la solution à analyser, cette température est maintenue par un circuit d'eau ou un effet Peltier. Ce maintien à température fixée est très utile dans les mesures de cinétique enzymatique, en effet, la vitesse de réaction dépend de la température ;
• une cuvette transparente dans laquelle on place la solution à étudier. Suivant la qualité et la quantité d'échantillon, il existe différentes cuvettes, généralement en plastique (spectre visible, UV proche) ou en quartz (UV, mais cuvettes très chères).

Le solvant et le(s) réactif(s) utilisés n'étant pas toujours transparents, il est obligatoire de réaliser un « blanc » ou témoin de compensation, c'est-à-dire une mise à zéro du dispositif (tarer), en ne plaçant que le solvant et le(s) réactif(s) utilisés dans la cuvette, avant la mesure de la cuvette contenant l'échantillon, et ce pour chaque longueur d'onde étudiée.
Les modèles de recherche sont généralement à double faisceau et utilisent deux cuvettes, la cuvette de référence contenant le solvant et le(s) réactif(s), et la cuvette contenant l'échantillon (avec solvant et réactif(s)). Le liquide de la cuvette de référence est alors soustrait automatiquement (fonction auto-zéro) ;

• une cellule photoélectrique, restituant un courant proportionnel au nombre de photons reçus. Sur des modèles récents, le détecteur unique de type photodiode est parfois remplacé par une barrette CCD, ou une barrette de diode (chaque cellule sensible reçoit une couleur fixe). Les modèles les plus sensibles utilisent un détecteur de type photomultiplicateur ou PMT ;
• un détecteur électronique dont la réponse est proportionnelle à ce courant électrique et permet une mesure relative de l'intensité lumineuse.

La spectrométrie est utilisée principalement pour connaître la concentration d'une solution colorée (procédé appelé dosage colorimétrique).

• Georges Bruhat, Optique, sixième édition, collection les cours de référence, Dunod, 2005, 1152 p.

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