Polylinker

Dans certains cas, un vecteur peut ne pas contenir un MCS, dans ce cas, un MCS peut être ajouté à un vecteur, cette même méthode peut être utilisée pour ajouter de nouveaux sites de restriction pour un site de clonage multiple[4]. La première étape est de concevoir des oligonucléotides complémentaires de séquences qui contiennent l'enzyme de restriction sites ainsi que d'autres bases sur la fin qui sont complémentaires du vecteur après digestion. Ensuite, les séquences d'oligonucléotides peuvent être recuits et ligaturé dans le vecteur digéré et purifié. Le vecteur digéré est coupé par une enzyme de restriction qui complète l'oligonucléotide. Après la ligature, le vecteur peut être transformé dans des bactéries. Le séquençage permet de vérifier l'insertion.

Un diagramme montrant le processus de l'insertion d'un site de clonage multiple dans un vecteur plasmidique.

Les sites de clonage multiples sont une fonctionnalité qui permet l'insertion d'ADN étranger sans perturber le reste du plasmide, ce qui le rend extrêmement utile dans la biotechnologie, bio-ingénierie, et de la génétique moléculaire. Un MCS peut aider à faire des organismes transgéniques, plus communément connu comme un organisme génétiquement modifié (OGM) à l'aide du génie génétique. Pour profiter de la STM en matière de génie génétique, un gène d'intérêt doit être ajouté au vecteur au cours de la production lorsque le MCS est coupé ouvert[5]. Après le MCS est fait et ligaturé il comprendra le gène d'intérêt et peut être amplifié pour augmenter le nombre de copies du gène dans une bactérie-hôte. Après la bactérie se multiplie, le gène d'intérêt peut être extraite de la bactérie. Dans certains cas, un vecteur d'expression peut être utilisé pour créer un produit de la protéine. Après les produits sont isolés, ils ont une grande variété d'utilisations telles que la production de l'insuline, la création de vaccins, la production d'antibiotiques, et la création de thérapies géniques.

Un plasmide bactérien utilisé dans le génie génétique comme un plasmide vecteur de clonage est pUC18. Son polylinker est composé de plusieurs enzymes de restriction des sites de reconnaissance, qui ont été conçus dans un seul cluster (le polylinker). Il a des sites de restriction correspondant à plusieurs enzymes de restriction, telles que EcoRI, BamHI, et PstI. Un autre vecteur utilisé dans le génie génétique est pUC19, qui est similaire à pUC18, mais son polylinker région est inversé. E. coli est aussi couramment utilisé comme hôte bactérien en raison de sa disponibilité, de son rapide taux de croissance, et de sa polyvalence[6].

Afin d'intégrer génétiquement l'insuline, la première étape consiste à découper le MCS du plasmide utilisé[7]. Une fois que le MCS est coupé, le gène de l'insuline humaine peut s'insérer, aboutissant au plasmide génétiquement modifié. Après cela, le plasmide est inséré dans la bactérie et peut se multiplier. Durant l'expérience les cellules de l'hôte sont mis dans une grande cuve de fermentation qui est leur environnement optimal. Le plasmide codera donc pour la fabrication d'insuline à l'intérieur de la bactérie. Le processus se termine par le filtrage de l'insuline à partir de l'hôte bactérien. L'insuline est ensuite purifiée des cellules, et peut être distribuée à des personnes atteintes de diabète.

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